基因编辑研究又下一城:更精准的CRISPR工具面世

来源:CNBETA  责任编辑:小易  

ZFNZFN,即锌指核糖核酸酶,由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA 识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成(一般 3~4 个),每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。锌指蛋白源自转录调控因子家族(transcription factor family),在真核生物中从酵母到人类广泛存在,形成alpha-beta-beta二级结构。其中alpha螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性,骨架结构保守。对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列,具有很强的特异性和可塑性,很适合用于设计ZFNs。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et al.,1996)。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶,只在二聚体状态时才有酶切活性(Kim et al.,1994),每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN,识别特定的位点,当两个识别位点相距恰当的距离时(6~8 bp),两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到 DNA 定点剪切的目的。TALENTALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶,TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶,它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割,从而导入新的遗传物质。相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)而言,TALEN能够靶向更长的基因序列,而且也更容易构建。但是直到现在,人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs。CRISPRCRISPR是生命进化历史上,细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器,简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌,利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务,细菌为了将病毒的外来入侵基因清除,进化出CRISPR系统,利用这个系统,细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除,这是细菌特有的免疫系统。微生物学家10年前就掌握了细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能,其中比较典型的模式是依靠一个复合物,该复合物能在一段RNA指导下,定向寻找目标DNA序列,然后将该序列进行切除。许多细菌免疫复合物都相对复杂,其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术,并先后对多种目标细胞DNA进行切除。以往研究表明,通过这些介入,CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变,效率比TALEN(转录激活因子类感受器核酸酶)等其他基因编辑技术更高。但最近研究发现,虽然CRISPR有许多优点,在人类癌细胞系列中,它也可能产生大量“误伤目标”,尤其是对不希望改变的基因做修改。三种系统的比较那么,可能会有人疑问了,既然如此,这三种系统的区别和联系又是什么呢?小编特意从有效性,特异性,载体性及其它四个方面,进行了一个小小的总结。有效性在不同的基因位点基因靶向性的有效性都是不同的,并且这也依赖于每种细胞的转染的效率。因此,只能点对点的比较靶向位点,细胞系和转染方法,这样的比较才有意义。基于我们课题组和其他课题组的ZFN和TALENs的靶向效率的实验,我们在细胞系水平上进行了比较,虽然他们可能与不同的突变特征有关。Chen的课题组的最近的研究进行了大规模的体外分析,发现TALENs在使用与上下游相关的序列的时候比ZFNs显著的具有更多的突变产生。另一个组比较了TALENs和CRISPRs在人类ESCs细胞中的情况,观察到,通过用CRISPR更换掉TALENs,在其他方面条件相同的情况下,通过产生更多的基因突变的克隆,本质上提高了效率。最近,功能上重新编码的TALENs(reTALENs)已经得到了发展,并且在人类的iPSCs细胞中的基因编辑的有效性相比较于CRISPR得到了提高。但是这个研究发现,CRISPR比reTALENs能够实现7-8倍的同源重组效率,并且其一定程度的比HE更有效率,挡雨ODN捐赠者进行比较。特异性ZFN和TALENs都是作为二聚体发挥作用的,其特异性是由DNA绑定的区域决定的,这个区域在每个剪切位点最多可以识别36bp。然而,在在II型CRISPR系统中的Cas9是由一种RNA引导的核酸,它的特异性是由PAM和PAM上游的20个引导核苷酸决定的。这表明,3’12个碱基的“种子序列”是最关键的,而剩下的8个碱基(非种子序列)甚至PAM序列都是可以错配的。ZFN的特异性由一种不带偏见的全基因组分析进行,并且发现存在频率低,但是可以检测到的脱靶事件的发生,其可以定义为一个高度有限的一部分。已经有研究表明,TALENs有比ZFN更低的细胞毒性和脱靶效率。基于这个研究,TALENs诱导的CCR5特异性突变在CCR5的对偶基因上发生率是17%,而在高度同源的CCR2位点上只有1%。相反,CCR5特异性的ZFN的活性在这两个位点是相在当的,CCR5位点的突变频率是14%,而CCR2的是12%。几个研究也报告了,CRISPR/Cas系统在细胞毒性评价或者DSB诱导的检测(即,H2AX免疫染色)中都没有明显的脱靶现象。然而,最近的研究发现,CRISPR诱导的靶向不同的人类细胞的基因出现了显著的脱靶现象。例如,靶向CCR5的CRSIPR/Cas9系统偶到的在CCR2上的脱靶切除的突变率为5-20%,这是非常接近之前讨论的CCR5靶向的ZFN诱导的突变率。三个其他的小组利用更系统的方法在人类细胞中评估了CRISPR的脱靶活性,其结果表明CRISPR可能能够发生目标不匹配,从而在预测的脱靶位点上引入微缺失或者插入(插入缺失)。此外,靶向位点的定位和内涵能够显著的影响gRNA识别他们的靶向目标,而在基因组序列中的“脱靶序列”也是一样的。已经有报告说,脱靶效应能够通过小心的控制Cas9的mRNA的浓度来克服。此外,在基因编辑的时候使用配对的Cas9的切口酶已经表明能够显著的减少至少1500倍的脱靶活性。病毒为基础的传递ZFN基因可以通过慢病毒和腺病毒进行传递。当前,ZFNs导入体细胞是通过共转染两个慢病毒载体,每个载体编码一个功能性异源二聚体对的一个单体。相反,腺病毒,但不是基于HIV的慢病毒,载体使用与TALEN的基因的传递,因为TALENs的大尺寸和TALE重复序列的种应用。Cas9也是一个较大的基因,并且其酶促死的版本也可以通过慢病毒进行传递,虽然也盛行的Cas9的稳定的表达对于细胞的毒性依然是不清楚的。其他方面ZFNs和TALENs都能够在切割时产生粘性末端,因此可以使用标签绑定,如果具有互补突出部分的双链寡聚核苷酸(dsODN)是可以进行预测的。ZFNs和TALENs都可以在捐赠的质粒的基因组中引入同一个核酸靶向位点来实现。ZFNs和TALENs通过采取同源二聚体的方式从而获得优势,绑定门通过设计实现了重组(Ob-LiGaRe)。这种方法在使用的质粒中倒置了两半的核酸酶的结合位点,这是在没有改变接头区的方向实现的,因此通过相同的ZFN/TALEN碱基对能够阻止连接产物的消化。因为CRISPR产生了一个非粘性末端,直接连接会遇到挑战。最近的文章表明,具有Cas9n的gRNAs的碱基对能够诱导具有徒步部分的DSBs,并且促进dsODN的高效率的NHEJ介导的插入。虽然至今还没有出版,但是进入的转基因大小的DNA能够通过引入在目标质粒的CRISPR/Cas9靶向位点的具有CRISPR/Cas的基因组使用。CRISPR/Cas系统相比较于ZFNs和TALENs具有几个优势,例如易于构建,花费低,并且产物具有可扩展性,并且能够用于多个靶向基因组位点www.zgxue.com防采集请勿采集本网。

而最近开发出来的一项新技术能够更准确地进行基因编辑——这一点对于开发基因疗法尤为重要。

有约1.6%的基因是人类与倭黑猩猩而非黑猩猩所共有的.同时也有相同数量的DNA是人类与黑猩猩而非倭黑猩猩所共有的.由此可见,黑猩猩与倭黑猩猩跟人类的接近程度几乎相同. 关于它们与灵长目其他生物跟人类的

与目前流行的CRISPR-Cas9体系相比(见图),一种名为“先导编辑”的新型基因编辑工具可以更精准地对DNA进行编辑。| 图片来源:Juan Gaertner/SPL

基因突变和基因重组的区别如下: 1、两者性质不同,基因重组是两种不同的基因组合在一起,形成新的基因片段。基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。2、基因突变是基因的从

这个被称为“先导编辑”的新方法能够更准确地对靶位点进行修饰,减少不必要的位点改变。10月21日,《自然》发表的一篇论文[1]描述了该工具,称其能够降低“脱靶”发生风险——标准CRISPR–Cas9体系在应用中的主要挑战之一,这意味着基于先导编辑的基因疗法具有更高的安全性。

克里夫和艾尔莎尤其擅长基因融合和基因杂交方面的研究。很多情况下,由基因杂交而诞生的物种有着更高的智慧、更强的身体机能。对于这两个科学家而言,经由他们的双手创造出来的生物就像潘多拉的宝盒一样

除了精准性,多样性是先导编辑的另一大优势——这种技术有望实现更广泛的基因修饰,也许未来的某一天,它能够解决现在许多基因编辑研究人员束手无策的遗传性疾病。博德研究所的化学生物学家David Liu是上述论文的通讯作者,据他估计,对于美国国立卫生研究院ClinVar数据库列出的75,000多个与疾病相关的DNA变异,先导编辑或许将帮助研究人员解决其中的近90%。

联系:都是基于基因基础开展的科学研究。区别: 一、指代不同 1、转基因技术:指利用DNA重组、转化等技术将特定的外源目的基因转移到受体生物中,并使之产生可预期的、定向的遗传改变。转基因

Liu表示这种新工具可以实现的基因编辑具有较高特异性,研究人员可以借助该特点在实验室中进行疾病造模,或对特定基因的功能进行研究。

父母肯定有的,只不过是父母都不知道他们的女儿会给人重新编辑了基因。现在很多医院是在患者做完试管婴儿成功后对遗留下来的胚胎都自行处理。也就是说一对夫妻一次配对成功了有十个胚胎,可能

“尽管现在尚属开发早期,但已有的结果看起来棒极了。”普林斯顿大学DNA修复与基因编辑研究员Brittany Adamson说,“它很快就会流行起来。”

先导编辑可能无法实现CRISPR–Cas9能够做到的大段DNA插入或删除,因此不会完全取代现有的成熟的基因编辑体系,马萨诸塞大学医学院的分子生物学家Erik Sontheimer说。这是因为在先导编辑中,需要修改的基因主要编码在一段RNA上,RNA链越长,就越容易被细胞内的酶破坏。

“不同类型的基因编辑需求,需要不同的基因编辑体系来实现。”Sontheimer说。

但相比目前其它的CRISPR替代基因编辑体系,先导编辑的基因编辑功能更加精准多样。这些体系包括改良版CRISPR–Cas9体系——让研究人员可以实现单个DNA碱基的替换;以及一些更老的基因编辑工具,比如锌指核酸酶,它们很难对单个DNA碱基进行编辑。

带着镣铐跳舞:自由与精准

CRISPR–Cas9和先导编辑均通过在基因组中的特定位点切断DNA发挥作用。前者会切断DNA双链,然后依靠细胞自身的修复系统来修补损伤并进行基因编辑。但这种修复系统可能在基因组被切断的位置插入或删除DNA碱基,并不全然可靠。因此,研究人员无法控制基因编辑的结果,细胞和细胞间也可能存在差异。

此外,即便研究人员加入了模板引导基因组编辑,相比在基因组中插入特定的DNA序列,大多数细胞中的DNA修复系统更倾向于插入或删除单个或少数几个碱基。因此,研究人员很难,甚至几乎不可能依靠CRISPR–Cas9体系将某个DNA片段替换为目标序列。

先导编辑则能绕开这些问题(参见“基因编辑进入精准时代”)。尽管它也和CRISPR–Cas9体系一样,使用Cas9识别特定的DNA序列,但先导编辑中的Cas9经过了改造,只切断1条DNA链,随后逆转录酶在RNA链的引导下在切断处进行基因编辑。

先导编辑酶不需要切断DNA双链,因此研究人员不必依靠他们无法控制的细胞DNA修复系统对被切断的DNA链进行基因编辑。这意味着借助先导编辑系统可以开发出基因突变相关遗传性疾病的治疗方法,而现有的基因编辑工具暂无法轻易做到这一点。

多用途基因编辑工具

此前,包括Liu在内的研究人员都认为需要针对具体的每一种基因编辑类型(如插入、删除、碱基替换等)开发基因编辑工具。如果想要进行精准替换,我们的选择非常有限。

之前还有一种技术被称为“碱基编辑”,其精准程度可以和先导编辑媲美。该技术可以通过化学方法在不切断DNA双链的情况下,直接实现碱基替换,比如将T换成A,G换成C——CRISPR–Cas9可做不到这一点[2]。这项技术也是由Liu开发出来的,有望用于治疗某些单基因遗传疾病,包括最常见的镰状细胞贫血。

但是,碱基编辑不能解决由多碱基突变引起的遗传疾病,例如泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease),这种通常具有致命性的疾病是由HEXA基因中误插入4个DNA碱基所致。

因此,Liu和他的同事开始着手开发新的精准基因编辑工具,他们对新体系的定位是灵活、易控制、能实现多种基因编辑功能。2018年,Liu的团队想到了先导编辑:这是一个由多种酶组合而成的体系,其中就包括改良的Cas9酶,能够在几乎不破坏DNA双链的情况下改变、删除单个碱基或插入小段DNA序列。

“这个技术非常棒。”Sontheimer说,“它能够实现多种形式的基因编辑,这是一项重大的突破。”

现在需要做的是评估该基因编辑体系如何能够在各种细胞和生物体内稳定运作。“这项研究只是生命科学领域一个长期目标的起点,而非终点,我们长久以来梦想着的是能够根据需要,对生物体基因组的任何位点进行任何改变。”Liu说。

两者有本质的差别。杂交技术主要作用于同一物种,虽然也有极少数不同物种能够杂交,例如马与驴杂交产生骡子。杂交的好处在于可以将同一物种不同的优良性状结合在一起,其背后的主要科学原理是孟德尔遗传定律。转基因则不同。它是把一段外源的基因(可以是其他的物种)植入到受体的基因组中。很早以前,我们就把胰岛素植入到了大肠杆菌的基因组,这样量产胰岛素就实现了e79fa5e98193e4b893e5b19e31333365666261,所以即使人们患了糖尿病,治愈费用也不会是天价。扩展资料:转基因技术的目的(1)提取目的基因 从生物有机体复杂的基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段,或者人工合成目的基因,或从基因文库中提取相应的基因片段和PCR技术进行目的基因的增殖。(2)将目的基因与运载体结合 在细胞外,将带有目的基因的DNA片段通过剪切、粘合连接到能够自我复制并具有多个选择性标记的运输载体分子(通常有质粒、T4噬菌体、动植物病毒等)上,形成重组DNA分子。(3)将目的基因导入受体细胞 将重组DNA分子注入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞),将带有重组体的细胞扩增,获得大量的细胞繁殖体。(4)目的基因的筛选 从大量的细胞繁殖群体中,通过相应的试剂筛选出具有重组DNA分子的重组细胞。(5)目的基因的表达 将得到的重组细胞,进行大量的增殖,得到相应表达的功能蛋白,表现出预想的特性,达到人们的要求。参考资料:百度百科-转基因技术内容来自www.zgxue.com请勿采集。


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