从基因工程乳酸菌中高效提取苯丙氨酸解氨酶的方法研究

・研究报告・ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ

２００８年第３期从基因工程乳酸菌中高效提取苯丙氨酸解氨酶的方法研究

陈星１

（

１

王璞２姚滢秋２肖白１

首都医科大学附属北京朝阳医院基础医学研究中心，北京１０００２０；２首都师范大学生命科学学院，北京１０００３７）

摘要：为从高表达苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）的基因工程乳酸乳球菌ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１４９－ｐａｌａｒｔ中有效提取所表达的

化学、生物学等方法，探索出一条简便、高效的技术路线。对提取物进行了ＰＡＬ酶，针对乳酸乳球菌的特点，结合各种物理、

酶活性测定、分析及细菌活性鉴定。结果表明，该混合法可以完全导致细菌死亡，所提取的酶蛋白结构完整，其酶活性达到了等量活菌的９２．５％，且该方法中所用到的各种试剂对体外培养细胞的生长无明显影响，为ＰＡＬ酶在科研及生物医药领域的应用提供了可靠来源。

关键词：

乳酸乳球菌

苯丙氨酸解氨酶

提取

ＳｔｒａｔｅｇｙｏｆＥｘｔｒａｃｔｉｎｇＰｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅＡｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅｆｒｏｍ

ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓＬａｃｔｉｓ

ＣｈｅｎＸｉｎｇ１ＷａｎｇＰｕ２ＹａｏＹｉｎｇｑｉｕ２ＸｉａｏＢａｉ１

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２

ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＣａｐｉｔａｌＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３７）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：（ＰＡＬ）ｆｒｏｍｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓＬａｃｔｉｓ（ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１Ｔｏｅｘｔｒａｃｔｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ

４９－ｐａｌａｒｔ），ｗｅａｐｐｌｉｅｄｍａｎｙｍｅｔｈｏｄｓｏｆｐｈｙｓｉｃｓ，ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｂｉｏｌｏｇｙｔｏｆｉｎｄａｓｕｉｔａｂｌｅｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｔｈｅｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｔｈｅｐｕｒｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｄｉｅｄａｂｓｏｌｕｔｅｌｙａｎｄｔｈｅＰＡＬｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗｅｒｅ９２．５％ｏｆｔｈｅｓａｍｅｗｅｉｇｈｔｌｉｖｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬ．Ｌ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｈａｓｎｏｎｅｇａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：

（ＰＡＬ）ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓＬａｃｔｉｓＰｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ

Ｅｘｔｒａｃｔ

苯丙氨酸解氨酶（ＰｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅＡｍｍｏｎｉａＬｙａｓｅ，ＰＡｌＥ．Ｃ．４．３．１．５）是高等植物苯丙酸类化合物代谢过程中的一个关键酶，可催化苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸和氨，已成为当前生物化工领域研究与开发的热点［１］。有研究表明，该酶在体内外可有效降低苯丙氨酸浓度，对苯丙酮尿症及某些底物依赖性肿瘤有治疗作用，在临床治疗领域亦有良好的应用前景［２￣５］。目前，ＰＡＬ酶虽可从水稻、小麦等植物中分离纯化，但工艺复杂、费用高，且天然来源的ＰＡＬ性质不稳定，生物半衰期短，难以适应大规模工业化生产的需求。

乳酸菌是一种重要的食品级微生物，它具有生长速度适中，易于培养，抗原性弱等特点，工业中可作为用于生产肽、酶或代谢物的宿主菌。乳酸菌基因表达系统构建已经成为许多人的研究课题，尤其是食品级的高效表达系统的构建和应用更是近年来的研究热点［６］。利用国际上最先进的乳酸乳球菌ＮＩＣＥ表达系统，并使用偏爱密码子成功获得了高效表达ＰＡＬ的食品级基因工程菌ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１４９－ｐａｌａｒｔ［７］。

乳酸乳球菌菌壁较厚且结构致密，传统的超声破碎和强度较大的细胞裂解液法难以在充分破碎菌体的同时保持外源蛋白的功能和结构完整。因此，基因工程乳酸菌外源蛋白的提取、纯化成为研究和应用中的难点。结合物理、化学和生物等方法，探索出一条从基因工程乳酸菌中简便、有效的提纯苯丙氨酸脱氨酶（ＰＡＬ）的技术路线。实验证明完全能够适应体外细胞学试验的要求，为基因工程乳酸菌的应用和ＰＡＬ酶的来源等相关研究开辟了新途径。

收稿日期：２００７－１１－２８

作者简介：陈星（１９７３－），实习研究员，研究方向：基因诊断与治疗，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉｎｇ１８７８５＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ

２００８年第３期陈星等：从基因工程乳酸菌中高效提取苯丙氨酸解氨酶的方法研究

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１实验材料与方法

基因工程乳酸乳球菌ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１４９－ｐａｌａｒｔ为北京朝阳医院基础医学研究中心自行构

１．１材料

１．１．１试验菌株

建并保存［７］。

１．１．２培养基和试剂①ＬＭ１７培养基（ｇ／Ｌ）：Ｍ１７Ｂｒｏｔｈ购自ＢＤ公司，含乳糖５．０％。②ＳＴＭ液：２５％蔗糖，

３０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ＝８．０），３ｍＭＭｇＣｌ２。③细胞裂解液：１ｍＭＤＴＴ，０．１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０），１０％甘油，用ＰＢＳ

（ｐＨ＝８．０）溶解。④诱导剂：Ｎｉｓｉｎ，购自Ｓｉｇｍａ公司。⑤青霉素：购自ａｍｒｅｓｃｏ公司，配制成５０００Ｕ／ｍｌ母液备用，工作浓度为１００Ｕ／ｍｌ。⑥溶菌酶：储存液５０ｍｇ／ｍｌ，工作浓度为５ｍｇ／ｍｌ，使用ＳＴＭ液（ｐＨ＝８．０）配制。⑦其它溶液：５０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ＝８．０），０．２５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０）。

１．２方法

１．２．１基因工程乳酸乳球菌的培养及诱导表达基因工程乳酸乳球菌ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１４９－ｐａｌａｒｔ在ＬＭ１７培养基中培养至ＯＤ６００＝０．４，加入诱导剂Ｎｉｓｉｎ，使其终浓度为１５ｎｇ／ｍｌ。继续培养５ｈ，ＯＤ６００≈１．６，离心５０００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ收集菌体，干燥后称重，－２０℃保存。

１．２．２自建从菌体中提取苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）的方法（１）将离心收集的干菌体每５ｍｇ用１００(ｌＳＴＭ液（ｐＨ＝８．０）溶解，加入终浓度为５ｍｇ／ｍｌ溶菌酶混匀，３７℃水浴２ｈ。（２）加入１／２体积冰浴冷的０．２５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０），冰浴５ｍｉｎ。（３）沿管壁缓慢加入１／２体积的５０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ＝８．０），３７℃水浴３ｍｉｎ。（４）磁力搅拌器上剧烈振荡１０ｍｉｎ。（５）加入溶菌酶至５ｍｇ／ｍｌ，青霉素至１０Ｕ／ｍｌ，３７℃水浴３ｈ。（６）立即投入－２０℃冰箱，并在－２０℃和３７℃度反复冻融１０次。（７）４℃，５０００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ离心收集上清液备用。（８）用与上清液等量的ＰＢＳ（ｐＨ＝８．０）溶解未经处理的原始菌，用于对照。１．２．３提取物ＰＡＬ酶活性检测

测定前加入１．２．３．１样品制备取２００μｌ提取物上清加入等体积的苯丙氨酸（１０ｍＭ），混匀。３７℃温浴１ｈ。

与混合液体等体积的高氯酸（５％），剧烈震荡混匀，４℃放置过夜。１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清ＨＰＬＣ法

测定反应产物肉桂酸含量。

１．２．３．２１．２．３．３

ＨＰＬＣ检测体系流动相为甲醇：去离子水：冰醋酸＝０．５∶０．５∶０．１％，流速为１ｍｌ／ｍｉｎ，紫外检测器波

根据国际酶学生化学会委员会规定［９］：１个酶活力（Ｕ），是指在特定条件

长２９０ｎｍ，上样量２０(ｌ［８］。配制肉桂酸标准品作为对照。

ＰＡＬ酶活性计算方法

下，１ｍｉｎ内能将１μｍｏｌ底物转化为产物所需的酶量，或是转化底物中１μｍｏｌ的有关基团的酶量；酶的比活力可用活力单位／毫克蛋白（Ｕ／ｍｇ蛋白）表示，也可用单位／克（Ｕ／ｇ）或单位／ｍｌ（Ｕ／ｍｌ）制剂表示。

１．２．４１．２．５

提取液中菌体存活情况检测混合法提取酶纯度鉴定

将处理后提取液在ＬＭ１７固体培养基中划线，３０℃恒温培养。连续观

察７２ｈ菌落生长情况。

采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳系统，分离胶浓度８％，积层胶浓度５％，稳流

８０ｍＡ电泳２．５ｈ。

２

２．１

实验结果

不同处理方法得到苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）活性

通过本处理方法得到的ＰＡＬ酶提取液，与苯丙氨酸（Ｐｈｅ）反应后ＨＰＬＣ检测代谢产物肉桂酸（ｃｉｎ）浓

表１为１ｇ基因工程乳酸菌经处理后，ＰＡＬ酶活性计算结果。从图１和表１可见，与同度结果，如图１显示。

量原始菌相比，所建立的混合法提取液ＰＡＬ活性达到同量活菌的９２．５％。

２．２提取液中菌体存活状况

为检测提取液中是否存在活菌，在ＬＭ１７固体培养基中划线培养７２ｈ，计数菌落数。结果显示经本法处

理后的提取液在７２ｈ内均无菌落生长迹象，说明该方法已经使菌体全部死亡。

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生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ

２００８年第３期图１

各方法提取物将Ｐｈｅ脱氨后产物ｃｉｎ浓度的ＨＰＬＣ检测图谱

ａ．未经处理基因工程菌ｂ．超声破碎法提取液

２．３提取过程所用试剂对体外细胞生长影响与提取过程中所使用试剂相同比例，配制样品

添加到本室培养的Ｕ２６６细胞培养液中；对照组加入等量的１６４０培养液。经过７２ｈ细胞培养、计数，观察试

剂对细胞生长情况的影响。从图２中可以看到，经过７２ｈ连续培养，对照组与实验组的细胞生长情况无明显差别，两组细胞数量均在培养２４ｈ左右达到峰值。两组细胞生长曲线基本一致，细胞数量相似，表明混合法中所使用试剂对细胞的正常生长并无影响。

２．４提取液ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析

经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳，可以从电泳图中看出在７５ｋＤ￣１００ｋＤ之间有明显的条带，与ＰＡＵ分子量

（７８ｋＤ）相符，如图３所示，而其它杂带较少。

图３

图２

Ｕ２６６细胞生长曲线图

提取酶液ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析

Ｍ．蛋白质ｍａｒｋｅｒＰ．提取酶液

３讨论

苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）在工业和医药领域具有广泛的应用前景［１０］。已利用几种大肠杆菌和乳酸菌表达

系统构建多株表达ＰＡＬ酶的基因工程菌，并使用偏爱密码子大幅度提高了表达量，获得活性高且易于培养的基因工程乳酸乳球菌ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１４９－ｐａｌａｒｔ。为从这一工程菌中简便、高效的提纯ＰＡＬ酶，尝试多种方法，最终总结出一套能够有效提取ＰＡＬ酶液，基本保持其原有活性，同时排除微生物污染，可直接用于细胞体外实验并满足工业或医药等用途的方法。

在对ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１４９－ｐａｌａｒｔ进行ＰＡＬ酶的提取过程中，也从试验中总结出很多经验。乳酸乳球菌属于格兰氏阳性菌，本身细胞壁比较致密，破坏难度大，较为激烈的处理方法会影响酶蛋白结构的完整性，使得酶的活性大大降低。经反复实验发现细胞裂解液法和超声破碎法都无法获得满意的结果，单以溶菌酶处理因此，选择以溶菌酶为主，结合改变细菌壁通透性的ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１４９－ｐａｌａｒｔ，获得的酶活性也并不是很理想。

经典方法，同时辅以振荡，冻溶等物理学手段，最终获得了较好的效果。

（下转第１３８页）

１３８

生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ

２００８年第３期大部分叶绿体的中间呈蓝黑色。因此，用此方法证明了所分离的叶绿体是较完整的。

蛋白样品的制备是蛋白质组学首要且关键的技术。为了对样品中的蛋白质作完全分析，必须对叶绿体进行有效地破碎，以获得尽可能多的蛋白。作者尝试了不同的方法（包括冻融法、研磨法、高压法及超声波法等）破碎叶绿体。实验中发现高压法和超声波法比较剧烈，在破碎叶绿体的过程中也伴随着色素等物质的释放，对后面的沉淀蛋白造成了较大的干扰，结果不理想（数据未显示）。而冻融法和研磨法操作较温和。但用这两种方法提取蛋白后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳结果证明：冻融法比研磨法提取的叶绿体蛋白电泳条带较多且较清晰。因此，冻融法可以作为盐藻叶绿体蛋白提取的较适宜方法。

且较完整的杜氏盐藻叶绿体；利用结果表明，高压破碎联合蔗糖密度梯度离心的方法能够获得较纯、

冻融法提取的叶绿体蛋白效率高，蛋白数量较多。这为下一步在亚细胞水平利用叶绿体蛋白进行杜氏盐藻蛋白组学分析奠定了基础。

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!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!（上接第１３４页）

对于提取过程中添加的各类试剂的种类和浓度，经过了严格的筛选。这些试剂都是在体外对细胞无毒害作用的无机物或酶制剂，细胞培养试验证明，适量添加这些试剂对细胞的生长没有明显影响，所得到的酶制剂可以直接应用于体外细胞试验。

乳酸菌为兼性厌氧菌，是一种重要的食品级微生物，对基因克隆和表达调控的研究，将会利用乳酸菌株／系产生多种有益的异源基因的产物。利用实验室现有的基因工程乳酸乳球菌，摸索出简便和高效的提取表达产物的方法。为今后基因工程乳酸菌的研究和应用提供了重要的技术基础。

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