化Ｓｕｍ２７６Ｎｏ．０９ 学工程师 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ２０１８年第ｏ９期 ＤＯＩ：１０．１６２４７￣．．２３－１１７１／ｔｑ．２０１８０９２０ 分 桥 测～畿～ ｃｎｋｉ一ＨＰＬＣ法测定 延胡索中黄连碱、去氢延胡索甲素、 延胡索乙素的含量掌 王雨笛 ，杨婧 ，吴高松 ，刘华 ，梁雅琪 ，王艳艳 （黑龙江中医药大学ａ．教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药天然药物药效物质基础重点实验室； ｂ．基础医学院病理学研究室；ｃ．中药药理学研究室，黑龙江哈尔滨１５００４０） 摘要：目的：建立反向高效液相（ＲＰ—ＨＰＬＣ）色谱法同时测定延胡索中黄连碱、去氢延胡索甲素、延胡索 乙素的含量测定方法。方法：采用Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＣ—Ｃ （２００×４．６ｍｍ，５１￣ｍ）色谱柱，流动相为乙腈一０．３％乙酸水溶液 （三乙胺调ｐＨ值为５．０），梯度洗脱，流速为ｌｍＬ·ｍｉｎ～，检测波长２８２ｎｍ。结果：４０ｍｉｎ内延胡索药材中黄连碱、 去氢延胡索甲素、延胡索乙素３个成分完全分离，峰面积与浓度呈现良好的线性关系（ｒ＝０．９９９５ ０．９９９９）；平 均加样回收率在９５．５％～９８．８％，ＲＳＤ为２．Ｏ％～３．Ｏ％。测定延胡索中黄连碱、去氢延胡索甲素、延胡索乙素含 量分别为１．９４％、２．２３％、Ｏ．５３％。结论：该方法快捷可靠，适用于延胡索中黄连碱、去氢延胡索甲素、延胡索乙素 ３个生物碱类成分的含量测定。 关键词：延胡索；ＨＰＬＣ；含量测定；黄连碱；去氢延胡索甲素；延胡索乙素 中图分类号：Ｒ２８４ 文献标识码：Ａ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ，ｄｅｈｙｄｒｏｆｕｓｏｎｅ ａｎｄ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐａｌｍａｔｉｎｅ ｉｎ Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ Ｒｈｉｚｏｍａ ｂｙ ＲＰ－ＨＰＬＣ ＷＡＮＧ Ｙｕ－ｄｉ ＹＡＮＧ Ｊｉｎｇ￣，ＷＵ Ｇａｏ—ｓｏｎｇ￣，ＬＩＵ Ｈｕａ ＬＩＡＮＧ Ｙａ—ｑｉ ＷＡＮＧ Ｙａｎ—ｙａｎ ａ．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ），Ｈｅｉｌｏｎｇｊａｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ＴＣＭ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｂａｓｅｓ；ｂ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ；ｃ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈａｒｂｉｎ １５００４０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ，ｄｅｈｙｄｒｏｆｕｓｏｎｅ ａｎｄ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐａｌｍａｔｉｎｅ ｉｎ Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ Ｒｈｉｚｏｍａｖｓｉｍｕｈａｎｅｏｕｓｌｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＣ－Ｃｌ８（２００ｘ４．６ｒａｍ，５ｐ，ｍ）ｃｏｌｕｍｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ．Ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ一０－３％ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｗａ— ｔｅｒ（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ａｄｊｕｓｔｅｄ ｔｏ ｐＨ５．０）ｗｉｔｈ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ａｔ ａ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ １ ｍＬ·ａｒｉｎ一．ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ２８２ｎｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｉｎ ４０ ｍｉｎ，ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｆ ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ，ｄｅｈｙｄｒｏｆｕｓｏｎｅ ａｎｄ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐａｌｍａｔｉｎｅ ｉｎ Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ Ｒｈｉｚｏｍａ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｓｅｐａｒａｔｅｄ Ｔｈｅ ｐｅａｋ ａｒｅａ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ（ｒ ．９９９５￣ ０。９９９９）．Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｗａｓ ９５．５．％～９８．８％ ｔｈｅ ＲＳＤ ｗａｓ ２．０％～３．０％．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐｔｉ— ｓｉｎｅ，ｄｅｈｙｄｒｏｆｕｓｏｎｅ ａｎｄ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐａｌｍａｔｉｎｅ ｉｎ Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ Ｒｈｉｚｏｍａ ｗｅｒｅ １．９４％、２．２３％、０．５３％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕ— ｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ．Ｉｔ ｉｓ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｏｆ ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ，ｄｅｈｙ— ｄｒｏｆｕｓｏｎｅ ａｎｄ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐａｌｍａｔｉｎｅ ｉｎ Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ Ｒｈｉｚｏｍａ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ Ｒｈｉｚｏｍａ；ＨＰＬＣ；ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ；ｄｅｈｙｄｒｏｆｕｓｏｎｅ；ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐａｌｍａｔｉｎｅ 延胡索ＣｏｒｙｄａｌｉｓＲｈｉｚｏｍａ为罂粟科（Ｐ印ａｖｅｍｃｅａｅ） 植物延胡索Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｙａｎｈｕｓｗｏ Ｗ．Ｔ．Ｗａｎｇ的干燥块 茎ｌｌ１，又名元胡、延胡、玄胡索，为紫堇属多年生草 本。延胡索具有活血散瘀、理气止痛的功效，主要用 于气滞血凝导致的心腹肢体疼痛等证 １。延胡索主 产于浙江和江苏，是浙江道地药材、著名的“浙八味” 之一。黄连碱、去氢延胡索甲素、延胡索乙素是延胡 索主要的生物碱类成分【３１，黄连碱、去氢延胡索甲 素、延胡索乙素具有双重抑制和选择性抑制血管平 滑肌细胞增殖、抑制Ａ型单胺氧化酶等广泛的药理 收稿日期：２０１８—０６—２５ 基金项目：国家自然基金青年金项目（Ｎｏ．８１６０３４１８） 作者简介：王雨笛（１９９４－），女，在读硕士研究生，主要从事中药药效物 质基础研究。 通讯作者：王艳艳（１９８２一），女，副教授，主要从事中药及复方药效物质 基础及其作用机制研究。 ２０１８年第０９期 王雨笛等：ＲＰ—ＨＰＬＣ法测定延胡索中黄连碱、去氢延胡索甲素、延胡索己素的含量’ ２１ 作用，是延胡索发挥镇痛、镇静解痉等药理作用的活 性成￣ｊＭ４－７］。近年来云南等地区的延胡索栽培面积也 不断扩大，有必要对其质量进行控制【圳。目前，采用 ＨＰＬＣ法对延胡索中化学成分的含量测定方法较 多，但是还未见到对黄连碱、去氢延胡索甲素、延胡 索乙素３种成分同时测定的文献报道。本研究建立 了同时测定延胡索中上述３种成分的ＲＰ—ＨＰＬＣ 法，实验表明该方法简单方便，结果可靠且准确，为 药材的质量控制提供了依据。 １实验部分 １．１仪器与材料 Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０型高效液相色谱仪（配备自动进样 器、柱温箱、四元泵，紫外检测器、Ａｇｉｌｅｎｔ色谱工作 站美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司）；ＭＥＴＦＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ电子天 平（上海梅特勒一托利多仪器公司）。 对照品黄连碱（化合物１）、去氢延胡索甲素（化 合物２）、延胡索乙素（化合物３）均由中国药品生物 制品检验所提供，采用面积归一化法测定其含量 均＞１９８％；药材购自河北安国市场，经黑龙江中医药 大学王振月教授鉴定为延胡索Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｙａｎｈｕｓｗｏ ｗ．Ｔ．Ｗａｎｇ的干燥块茎；乙腈作为ＨＰＬＣ流动相为色 谱纯，美国Ｆｉｓｈｅｒ公司；实验用水为娃哈哈纯净水， 杭州市娃哈哈集团有限公司；其余试剂均为分析纯。 １．２实验方法 １．２．１溶液制备混合对照品溶液：取一定量的黄 连碱、去氢延胡索甲素、延胡索乙素对照品粉末，精 密称定，加入适量甲醇定容，配制成每毫升溶液中含 有黄连碱１００．２ ｇ、去氢延胡索甲素１００．１ ｇ、延胡 索乙素１００．１Ｉ．Ｌｇ的混合溶液，即得。 供试品溶液：粉碎药材，取药材粉末约０．５ｇ，精 密称定，精密加入水２０ｍＬ，超声（２５０ Ｗ，４０ ｋＨｚ）提 取２次，每次３０ｍｉｎ，滤过且合并滤液，定容到１００ｍＬ 量瓶中，经０．２２ ｍ微孑Ｌ滤膜过滤，取续滤液即得。 １．２．２色谱条件采用Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＣ—Ｃ１８（２００×４．６ｍｍ， ５１￣ｍ）色谱柱，以乙腈为流动相Ａ，以０．３％的乙酸水 溶液（三乙胺调ｐＨ ５．０）为流动相Ｂ，梯度洗脱，洗脱 条件见表１，检测波长：２８２ｎｍ；柱温：室温；进样量： １０ｔｚＬ。 表１ 延胡索含量测定流动相梯度洗脱条件 Ｔａｂ．１ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ Ｒｈｉｚｏｍａ １．２＿３线性关系考察精密吸取“１．２．１”项下混合对 照品溶液１、２、４、６、８、１０ｍＬ分别置于１０ｍＬ容量瓶 中且定容至刻度，按“１．２．２”项下的色谱条件进样测 定，以浓度和对应峰面积计算其回归方程。 １．２．４精密度考察取“１．２．１”项下混合对照品溶 液，按照“１．２．２”项下色谱条件连续进样６次，得到化 合物１～３的ＲＳＤ值。 １．２．５稳定性考察取供试品溶液于室温下放置， 分别于０、２、４、８、１２ｈ按照上述色谱条件进行进样测 定，得到化合物１—３的ＲＳＤ值。 １．２．６加样回收率考察精密称定６份样品，每份 ０．５ｇ，分别精密加入低、中、高３种浓度的对照品储 备液（每个加入量３份），按照“１．２．１”项下制备供试 品溶液，然后按“１．２．２”项下色谱条件测定，计算回收 率。 １．２．７重复性考察取６份延胡索药材粉末，每份 １．Ｏｇ，按“１．２．１”项下所述方法分别制备供试品溶液， 依照“１．２．２”项下色谱条件进行含量测定，得到化合 物１ ３的ＲＳＤ值。 １．２．８样品含量测定分别取不同产地延胡索提取 物样品适量，按上述方法进行测定，由回归方程计算 样品中黄连碱、去氢延胡索甲素、延胡索乙素的含 量。 ２结果与讨论 ２．１结果 ２．１．１色谱条件在“１．２．２”项下色谱条件下，黄连 碱、去氢延胡索甲素、延胡索乙素的色谱峰达到比较 理想的分离效果，理论塔板数按照被测成分色谱峰 计算均不低于３０００。对照品及样品色谱图详见图１。 ２．１．２线性关系考察化合物１～３的回归方程分别 为Ｙ＝１２．０３２Ｘ一４．０２２（ｒ＝０．９９９９），线性范围１００．２～ ６．２ ｇ·ｍＬ－ ；Ｙ＝１５．２７７Ｘ＋３．７６９（，＝０．９９９９），线性范 围１００．１～６．０ ｇ·ｍＬ－ ；Ｙ＝１０．６２８Ｘ一１．４２７（ｒ＝０．９９９９）， 线性范围１００．１～５．８ ｇ·ｍＬ一。 ２．１＿３精密度考察结果化合物１～３峰面积ＲＳＤ 王雨笛等：Ｒｐ—ＨＰＬＣ法测定延胡索中黄连碱、去氢延胡索甲素、延胡索乙素的含量’ ２０１８年第０９期 分别为０．５４％、０．７２％、０．４５％，表明仪器的精密度良 经过多次预实验，选择乙腈－０．３％乙酸水溶液（三乙 胺调ｐＨ值为５．０）流动相系统梯度洗脱最佳，分离 度适宜，所得峰形对称，可以提高检测灵敏度、减少 背景噪音的干扰，由于水相中加入三乙胺基线平缓， 所以选择加入三乙胺调节ｐＨ值，由此相邻色谱峰 均可达到基线分离。 ２．２．２含量测定结果分析由表２可知，来自３种 好ｏ １００１ ９Ｏ ８０ ７０ ６０ 宅５０ ４０ ３Ｏ ２０ １Ｏ 产地的延胡索测得的３种成分含量范围分别为黄连 碱１．２５％～２．０３％、去氢延胡索甲素０．１３％～２．２３％、延 ０ ５０ ４０ 呈３ｏ ２Ｏ １Ｏ ０ ｌＵ ２０ ３Ｕ ４０ 时间／ｒａｉｎ １．黄连碱（ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ）２．去氢延胡索甲素（ｄｅｈｙｄｒｏｆｕｓｏｎｅ Ａ） ３．延胡索乙素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐａｌｍａｔｉｎｅ） 图１对照品与样品的ＨＰＬＣ色谱图 Ｆｉｇ．１ ＨＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ［Ａ） ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ［Ｂ） ２．１．４稳定性考察结果化合物１～３峰面积ＲＳＤ 分别为０．６２％、０．８９％、０．４７％，表明供试品溶液稳定 性在１２ｈ之内良好。 ２．１．５加样回收率考察得到化合物１￣３平均加样回 收率分别是９５．５％（ＲＳＤ＝２．１％）、９ ６．１％（ＲｓＤ＝２．５％）、 ９８．８％（ＲＳＤ＝２．９％）。 ２．１．６重复性考察 测得样品中化合物１～３的 ＲＳＤ分别为２．１％、０．９％、１＿３％。各ＲＳＤ＜３％，表明该 方法重复性良好。 ２．１．７样品含量测定黄连碱、去氢延胡索甲素、延 胡索乙素的含量测定结果见表２。 表２延胡索中黄连碱、去氢延胡索甲素和延胡索乙素 的含量（％） Ｔａｂ．２ Ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ，ｄｅｈｙｄｒｏｆｕｓｏｎｅ Ａ ａｎｄ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐａｌｍａｔｉｎｅ ｉｎ Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ Ｒｈｉｚｏｍａ（％） ２．２讨论 ２．２．１流动相的选择分别考察了乙腈一水、乙腈 一０．３％乙酸水、甲醇一水等流动相系统，综合考虑并 胡索乙素０．４２％～０．７５％，依照２０１５年版《中国药典》 （一部）“延胡索”项下仅测定的延胡索乙素含量规 定——含延胡索乙素（ｃ 。Ｈ笛ＮＯ ）不得少于０。０５０％， 本次实验测定的３批药材均符合药典规定。但黄连 碱及去氢延胡索甲素含量差异较大，可见仅由延胡 索乙素的含量衡量延胡索药材的优劣不免有失偏 颇，而测定延胡索药材中３种生物碱成分的含量来 评价其质量则更全面。３批药材中黄连碱及去氢延 胡索甲素的含量差异较大与产地是否有关还有待进 一步实验研究。 ３结论 本实验首次对延胡索中的黄连碱、去氢延胡索 甲素、延胡索乙素３种成分的含量同时进行测定，实 验表明该方法简洁，重复性以及分离度较好，结果准 确、具有可重复性，为延胡索中黄连碱、去氢延胡索 甲素、延胡索乙素的测定提供了一定的依据。 参考文献 ［１］国家药典委员会．中华人民共和国药典［ｓ］．一部．北京：中国医药 科技出版社。２０１５：１３９—１４０． ［２］林家寿．高效液相色谱法测定延胡索中延胡索乙素、延胡索丙 素、小檗碱的含量及不同炮制品稳定性研究［Ｊ］．世界中西医结 合杂志，２０１６，１１（３）：３４８—３８０． ［３］汤法银，聂爱国，李艳玲．中药延胡索的研究进展［Ｊ］．临床和实 验医学杂志，２００６，５（２）：１８５—１８６． ［４］张志辉，邓安瑁，于金倩，等．黄连碱药理活性研究进展［Ｊ］．中国 中药杂志，２０１３，３８（１７）：２７５０—２７５４． ［５］李玉山．延胡索乙素的制备工艺及药理作用研究进展［Ｊ］．解放 军药学学报，２０１３，２９（５）：４８０—４８３． ［６］杨鑫宝，刘扬子，杨秀伟，等．磐安延胡索的化学成分研究［ｎ中 草药，２０１３，４４（１６）：２２００—２２０７． ［７］王登峰，罗云．ＨＰＬＣ法同时测定延胡索中３种生物碱类成分的 含量［Ｊ］．中国药房，２０１２，２３（３１）：２９５１—２９５３． ［８］王云龙，陈晓辉，许世伟，等．高效液相色谱法同时测定元胡止痛 片中欧前胡素、延胡索乙素与异欧前胡素的含量［Ｊ］．药品鉴定， ２０１０，７（１）：５８—５９． ［９］张颖，龙全江，徐雪琴．不同产地延胡索中生物碱类成分的含量 测定及质量分析［Ｊ］．中药材，２０１７，４０（１）：７３—７６．