LAMP技术检测结核分枝杆菌的临床时效性分析

,,,国际检验医学杂志２０１８年７月第３９卷第１３期　IntJLabMedJul０１８Vol．３９No．１３y２

论著􀅰临床研究

LAMP技术检测结核分枝杆菌的临床时效性分析

()深圳市宝安区慢性病防治院检验科,广东深圳５１８１０２

陈　伊,黄文焰,邓君丽

∗

抗酸染色涂片法及LMcNemar检验和Kaa检验.结果　１４０例痰标本中,AMP法的阳性检出率分别为pp

/)/).与抗酸染色涂片法比较,/、和４特异度为２９．３％(４１１４０５．０％(６３１４０LAMP法的灵敏度为９７．６％(４０４１)结论　痰标本检测中,批量检测性好,具有较好的临床应用前景.LAMP法阳性检出率优于抗酸染色涂片法,

:/DOI１０．３９６９．issn．１６７３Ｇ４１３０．２０１８．１３．０２３j

()文章编号:１６７３Ｇ４１３０２０１８１３Ｇ１６２２Ｇ０４

关键词:结核分枝杆菌;　环介导等温扩增;　结核;　诊断

文献标识码:A中图法分类号:R４４６．５

目的　探讨环介导等温扩增法(检测结核分枝杆菌在基层诊疗机构中的临床应用价值.　　摘　要:LAMP)

方法　采用LAMP法及抗酸染色涂片法对１４０例临床诊断为肺结核的患者的痰标本进行检测.统计分析采用

/),/.两种方法一致性相比,总体一致率８差异有统计学意义(７６．８％(７６９９２．９％(１１６１４０)Kaa＝０．６４２,pp

),两者一致性良好.在检测时间上,与涂片法相比,大批量标本检测中LP＜０．０５AMP法所用时间较短.

methodfordetectionofMcobacteriumtuberculosisinthealicationofprimaredicalinstitutions．yppymLAMPandantiＧacidstaininethod．McNemartestandKaatestwereusedforstatisticalanalsis．gmppy

Results　In１４０casesofsutum,thepositivedetectionrateofantiＧacidstaininndLAMPmethodwaspgaMethods　Thesutumsamlesfrom１４０patientswithclinicallianosedpulmonartuberculosisdetectedbppydgyy

:AbstractObective　ToexloretheclinicalvalueofalooＧmediatedisothermalamlification(LAMP)pppj

(DeartmentolinicalLaboratorBaoanDistrictChronicDiseaseControlInstitute,pfCy,

Shenzhen,Guandon１８１０２,China)gg５

∗

ClinicalefficiencnalsisofMcobacteriumtuberculosisdetectedbAMPtechniueyayyyLq

CHENYi,HUANGWenan,DENGJunliy/)/),２９．３％(４１１４０and４５．０％(６３１４０．ComaredwiththesmearmethodthesensitivitfLAMPmethodwaspyo

/),//９７．６％(４０４１thesecificitas７６．８％(７６９９)．Theoverallconsensusratewas８２．９％(１１６１４０)．ComＧpyw,takesshortertime．Conclusion　InsutumsamledetectionositivedetectionrateofLAMPmethodisbetterthanpppantacidstaininmearmethod．Ithasgoodbatchdetectionabilitndgoodclinicalalicationprosect．gsyappp

:;;;KeordsMcobacteriumtuberculosis　looＧmediatedisothermalamlification　tuberculosis　yppywdianosisg

　　结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染

病,具有治疗周期长,药物疗效一般等特点,在全世界范围内已成为严重危害公众健康的公共卫生问题.在我国２０１０年全国第５次结核病流行病学调查结果显示,结核病负担严重,如何高效的防治结核病成为

]１

.目前结核病的诊断技急需解决的重要问题之一[

,(aredwiththetwomethodstheconsistencetweenthetwoismoderateandstatisticallinificantKaa＝pybysgpp

),０．６４２,P＜０．０５．ComaredwiththesmearmethodtheLAMPmethodusedinlareＧscalesecimenexaminationpgp

是急需解决的问题,也是结核病防治的重要环节及迫切需要.环介导等温扩增技术(是一种新型LAMP)核酸检测技术,与传统的核酸扩增技术相比,其只需恒定温度就能进行扩增反应.日本学者NOTOMI

２]等[在２这一技术自创建以０００年创建了这一技术,来,就得到了广泛的关注,很多研究学者将其应用于

３Ｇ６]

,多个领域[并取得了一定的应用研究价值.

术对于日益提高的临床需求来说,具有相对的落后性,开发更加适于临床需要的结核病诊断技术及产品

∗

).基金项目:深圳市宝安区医疗卫生科研立项项目(２０１６CX２２３

由于基层结核病诊疗机构的设施环境及人员素

陈伊,女,主管技师,主要从事结核病检验诊断研究.　　作者简介:

]():陈伊,黄文焰,邓君丽．国际检验医学杂志,　　本文引用格式:LAMP技术检测结核分枝杆菌的临床时效性分析[J．２０１８,３９１３１６２２Ｇ１６２４．

,,,国际检验医学杂志２０１８年７月第３９卷第１３期　IntJLabMedJul０１８Vol．３９No．１３y２

􀅰１６２３􀅰

质数量等与大型医疗机构相比,无论在资源还是技术水平上都相对欠缺,加之来基层诊疗机构的结核病患者就诊量大,集中等特点,本课题将具有操作简单且快速特点的L检AMP技术应用于肺结核病患者中,测其结核分枝杆菌,并通过与目前常规诊断方法抗酸染色涂片法进行对比,以此来分析LAMP技术在检测结核分枝杆菌的时效性,评估该技术是否适于结核病诊断的常规临床应用.

１　资料与方法

１．１　一般资料　选取本院２０１６－２０１７年临床诊断为肺结核的患者作为本次研究对象,共１４０例.

Kaa一致性检验.对计量资料采用百分比描述.pp

２

方法间率的比较采用χ检验,P＜０．０５表示差异有统计学意义.

２　结　　果２．１　检测效能分析　１４０例临床诊断为肺结核患者的痰标本进行抗酸染色涂片法及L其AMP法检测,阴性７LAMP法检测出阳性６３例,７例.抗酸染色涂

/片法及LAMP法的阳性检出率分别为２９．３％(４１中抗酸染色涂片法检测出阳性４阴性９１例,９例,

)/.L和４１４０５．０％(６３１４０)AMP法的阳性检出率比

抗酸染色涂片法的阳性检出率高约１５．０％.与抗酸(．２　仪器与试剂　LAMP法试剂盒及恒温扩增仪斯株式会社广州迪澳生),物抗酸染色液科技有限公(珠海贝索生物技术有限公司),显微镜(日本奥林巴司),阴阳性质控菌株:结核分枝杆菌病防治中心７２９４)与大肠埃希菌H３７Rv(ATCC

.

(ATCC２５９２２)来自深圳市慢性．３　方法断为肺结核患者送检的合格痰标本　采集１４０例本院２０１６,－进行抗酸染色涂２０１７年临床诊片及．３．１L　AM抗酸染色涂片镜检法P法检测.

标本进行染色,具体步骤严格　采用萋尼染色法对痰按照«中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册»要求进行操作.镜检报告标准:抗酸杆菌阴性(察－):连续观~３未发现抗酸杆菌８００个视野,

;报告抗酸杆菌菌数:条抗酸杆菌/３００视野;抗酸杆菌阳性(条抗酸杆菌/:抗酸杆菌/１０１０视野０视野;抗酸杆菌阳性(＋;抗酸杆菌阳性(＋＋)抗酸杆菌/每视野;抗酸杆菌阳性(＋＋＋):;１)~３９~条９抗酸杆菌/每视野.

＋＋＋＋):１≥~１９条０条．３．２　LAMP技术

．３．２．１　DNA制备积的　在待检样本痰中加入相同体吸取４％氢氧化钠,涡旋振荡１,室温放置１,m/imni１mL加入带旋盖离心管中５s,离心５min(５m１２０in(n

),弃上清,加入１mL生理盐水混匀,再离心００

５mLi．３n,．(涡旋１２００２１２０．２　０混０r０匀/核酸扩增r/１mm５sin)in),,弃上清,加入DNA提取液,恒　取上清液备用温１００℃加热将２μL上清液加入反应管中,上清液即模板１０min,离心１００

.２,每支反应管中分别含酶、２０μL密封液,离心２５s２μL反应液、１００００r/m１inμ)L,６３Bst聚合

(℃恒温扩增仪扩增．３．２．３　结果判定４５min

.　显示“阳性,表明含有结核分枝杆菌S

”,型扩增曲线否则判断为阴性,则判断为,不含有结核分枝杆菌.

．４　统计学处理方法间配对计数资　采用料的比SP较SS采１７用．０进行统计分析,McNemar检验和

染色涂片法比较,４８１２)．９、特异度为％(１１６/１４７LAMP法的灵敏度为０６)．８.％将(７抗６/酸９９染)

,色两方法的９涂片法及总７．６％(４０/进行一致性分析,Kappa统计量判断标准:L体KAM一appP致率法０中．４;,一致性程度弱;０．４一致性程度适a≤K０．６＜Kaa≤０．＜Ka一pp

致a≤性０程．６,度良好;示ap:p两a≤方１法．０的,一致性程度最佳pp８,一致性分析中.,检测结果统计分析显０．８＜０分析．６＜K,两ap方pa法≤阳０．性８,检两者一致性良好Kapp

出率比较,差异.a＝０M有c统N．６e４计m２a学r,介检验于意义

(P＜０．０５

表１　　L),见表AMP１法与抗酸染色涂片法的效能分析.(n)

项目涂片阳性涂片阴性合计LLAMAMP阳性P４０２６阴性７３合计

４１１

７３９６９

１４０７

２．２　抗酸染色涂片法分级«中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及　抗酸染色涂片法的分级

按照质量保证手册»中的镜检报告标准进行.将法检测结果与抗酸染色涂片法的分级结果进行比较LAMP,在涂片阴性的标本中(２３/９９),在涂片结果１L~AM８条P法阳性检出率约/“２及３以％

上的痰标本中,有在“LAMP法阳性检为３００视野、１００％(２＋７/＋２７”

),只本中相差最大＋”及阴性的痰标本中存在差异.见表表２　　LAMP法与抗酸染色涂片法分级结果比较２.

,其中痰涂阴标(n)

涂片分级总例数阴性

１９９LAM２P阳性

３＋~８条/３００视野＋＋

１１

１４３１３１

＋＋＋

７１３＋＋＋＋

６７６１２１１１１１rμ１１１􀅰１６２４􀅰

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３　讨　　论

其中乡村活动性　　目前我国结核病发病形势严峻,

发病率高于城镇发病率,各地区活动性发病率不

１]

,同[提高结核病的诊断及治疗能力,对结核病的防

用时间约２h,比抗酸染色涂片法平均１．５h所用时间长,时间方面不具有优势,但抗酸染色涂片法需要人工镜检,人员要求高.实际上在基层诊疗机构,日均就诊量大,专业人员紧缺.以本院疑似结核的就诊患者为例,日均２高峰期５每人留痰３０~３０人,０多人,盒,行３张涂片镜检,即每天至少要镜检６０多张痰在综合成本以及效能上,LAMP技术对于大批量标本的检测比抗酸涂片法具有较大优势,其大大降低了诊断延误的时间和概率.综合临床实际检测需要,治工作具有重要意义.结核病患者治疗周期长,通常需要６个月的治疗时间,早期准确的诊断结核病,能够使患者得到及时有效规律的治疗,减少耐药发生的风险,提高治愈率.

现有的结核病诊断技术包含有细菌学诊断、免疫学诊断及临床影像学诊断等,免疫血清学检测虽具有快速、操作简单等优点,但目前未发现具有确诊效能

片,最多时１两人操作,至少１d时间,检测压００多张,

力大,而使用LAMP技术只需一人约４h既能完成.

的标志物[７

]菌学诊断.,本因此结核病的实验室检查主要依赖于细

研究应用的抗酸染色痰涂片法具有快速,便宜等优点,是目前基层结核病诊疗机构常规的结核病检测项目.在对于患者的痰标本进行抗酸染色痰涂片法１４０例临床诊断为肺结核,结果显示阳性检出率为痰液样本的性状２９．３％((干酪样４１/１４０、)黏液,阳性检、血痰出、率唾液并不),高样本量,其中,

送检的次数、咳痰方式、镜检视野数、检验人员的专业度等都对该方法的阳性检出率有一定的影响.李源

等[８]

的研究显示痰的不同性状对于痰涂片阳性率存

在影响,且痰涂片法的阳性率低.实际上本研究在痰标本收集时,往往因为患者咳痰方法错误,留痰次数及时间不对等多种原因,造成痰标本不合格而需要重新收集.有些患者往往无痰或只有极少量痰,这些都给临床检验诊断造成了不便,延误诊治时间.LAMP技术是一种快速诊断技术,其以核酸扩增技术为基础,在NA聚合酶进行６０~６反应５,

全℃等温条件下使用高效的过程(包括样本的处理)约用的２h[２

]PCR.实验该技术与传统的室场地,无需P昂CR技术相比,

其无需专贵的核酸扩增仪和检测设备,其要求的基础投入少,相较于基层结核病诊疗机构相对落后的设施环境以及较少的医疗投入而言,该方法更为适用于基层诊疗机构的临床应用.在应用内外研究显示该技术具有很好的LAMP技术对结核分枝杆菌进行诊断方面,国临床应用价值[

９Ｇ１６]

本研究结果显示,.涂片法高约６１５．０L％AM,P法的阳性检出率比抗酸染色灵敏度为９７．６％,

特异[９Ｇ１度０,１６为]

研究同样表E．８DD％Y,这等[与１２]

国在应用内研明LAMPL究者的研究结果相似.技AM术P技术对南非结核患者的敏感性明显高于涂片法.在两种方法的一致性分析中,本研究结果显示符ap[９

p

]a＝０．一致性良好,这与国内研究报道相的不同.L,A使得其对结核杆菌在痰液中的检出量要求更低

M６P４２法阳性率高的原因可能是由于方法学上,造成的,且专业人员的专业水平也对其有一定影响.

在本研究中,单个标本急诊检测时,LAMP法所

AMP技术能适用与大批量标本检测,

且对人员设备要求较低.在生物安全方面由于应始终在密闭的反应管中进行,从而降低了实验人员LAMP法的整个反的感染风险,与抗酸染色涂片法相比,其更为安全.　结　　论

　　LAMP法与涂片法相比,其能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌,由于结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌感染的治疗的差异,这有助于临床制定正确的治疗方案.但是LAMP法不能区分死菌及活菌,这不利于临床判断是否为活动性肺结核,在一定程度上影响了其临床效能.在成本方面,００~３００元,

而涂片法只需几十元LAM且由P法检测费用

于政府补助,大部分就诊者可以免费检测,涂片法优于LAMP法.大部分的结核患者家庭年收入水平低于全国平均水平,生活贫困,难以承担高额的医疗费用,本,接近或略高于涂片法的LAM话,P法检测如能降低成将具有更好的临床应用前景.综上所述,在痰标本检测结核分枝杆菌中,LAMP法时效性高,在一定程度上适于医疗机构的临床应用.参考文献

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L４２D７RK􀅰１６２８􀅰

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