实验设计报告

实验名称：酶的特征性常数Km值得测定方法实验设计 实验小组成员：曾杰，胡佳，王霞，查扬眉，赖志强

实验地点： ；实验日期： 【实验目的】

1， 2，

了解利用双倒数法测定Km值得原理。 掌握碱性磷酸酶活性测定的基本原理。

【实验原理】

在温度，Ph及酶浓度恒定的条件下，酶促反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即v=Vmax[S]/(Km+[S],Km值为米氏常数，其物理意义为反应速度（v）达到1/2Vmax时的底物浓度（即Km=[S]）,单位一般为mol/L,只由酶的性质决定，而与酶的浓度无关。 酶促反应中的Km和Vmax值有几种测定方法，固定反应中的酶浓度，然后分析几种不同底物浓度下的起始速度，就可获得Km和Vmax值，但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km和Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程，所以通常都是利用米氏方程的转换形式求出Km和Vmax值，常用的米氏方程转换形式是Lineweaver-burk[林-贝氏]方程，也称为双倒数方程。

使1/v对1/[s]作图，可以获得一条直线，从直线与x轴的截距可以得到1/Km的绝对值，而1/Vmax是直线与y轴的截距，双倒数作图直观、容易理解、为酶抑制研究提供了易于识别的图形，即：1/v为纵坐标，1/[s]为横坐标作图，可得一条直线（如下图所示） 图中直线与纵坐标的交点为1/Vm,其延长部分与横坐标的交点为-1/Km，从交点的数值可分别求出Vm及Km值。

碱性磷酸酶主要存在于肝、骨、胎盘、小肠及血清中，能以多种人工或天然磷酸为底物，催化其水解脱磷酸，由于其最适pH约为10，故称为碱性磷酸酶，一些二价阳离子Mg等是碱性磷酸酶的激动剂，而CN等是该酶的抑制剂，是动物体内存在的普遍的一种酶，来源丰富。

1， 检测波长为404nm下碱性磷酸酶的Abs, 利用坐标图求出反应初速度； 2， 再以各管的1/v为纵坐标，各管的底物浓度的倒数1/【s】为横坐标，作双倒数

图；

3， 根据双倒数图，求出Km值。

【实验仪器与耗材】

仪器：721-B型分光光度计，比色杯，吸量管，可调式移液器 耗材：200uL吸头，试管等

【实验试剂】

1， 2， 3，

碱性磷酸酶溶液 碳酸盐缓冲液 Mgcl2溶液

4， 5， 碳酸盐缓冲液

对硝基酚酸酯（底物） 【操作步骤】 试剂（ml） 1 2 0.4 0.6 1.0 0.1 1.0 － 3.0 3 0.6 0.4 1.0 0.1 1.0 － 3.0 4 0.8 0.2 1.0 0.1 1.0 － 3.0 5 1.0 － 1.0 0.1 1.0 － 3.0 6 1.0 － 1.0 － 1.0 0.1 3.0 2.5mM磷酸苯二0.2 钠 蒸馏水 0.8 碱性缓冲液 碱性磷酸酶 酚试剂 碱性磷酸酶 10%碳酸钠 1.0 0.1 1.0 － 3.0 混匀后，37℃水浴5min 混匀后，37℃水浴15min(准确计时） 混匀后，37℃水浴15min,以第6管调0与404nm比色，读取各管A值。 1.取小试管5支，编号按下表稀释底物：（单位ml） 管号 试剂(ml) 0.02mol/L磷酸苯二钠 蒸馏水 1 1.0 0 2 1.0 1.0 3 1.0 2.0 4 1.0 4.0 5 1.0 8.0 2. 取试管7支，按下表操作：(酶促反应) 管号 试剂(ml) 上表对应稀释液 血清 PH=10的缓冲液 1mmol／L酚标准应用液 1 1.0 0.1 1.0 — 2 1.0 0.1 1.0 — 3 1.0 0.1 1.0 — 4 1.0 0.1 1.0 — 5 1.0 0.1 1.0 — S — — 1.0 0.1 C — 0.1 1.0 — 蒸馏水 — — — — — 1.0 — 37℃水浴15分钟。 向各管加入下列试剂(显色) 碱性液 0.01mol/L磷酸苯二钠 4—氨基安替吡啉 铁氰化钾溶液 2.0 — 1.0 1.0 2.0 — 1.0 1.0 2.0 — 1.0 1.0 2.0 — 1.0 1.0 2.0 — 1.0 1.0 2.0 — 1.0 1.0 2.0 1.0 1.0 1.0 充分混匀，以C管调零点和100%，用404nm波长比色，读取各管吸光度值。 3．计算： 反应速度V即酚的生成量，根据 4．作图： （1）列表 根据不同的[S]和测得的不同V，求出相对应的1/[S]和1/V，并列表。 管 号 1 2 3 4 5 [S] 9.50 7.16 4.75 3.80 2.85 1/[S] 0.11 0.21 0.31 0.53 0.94 V 1/V （2）作图 取一张坐标绘图纸，以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标作图，以1/V对1/[S]作图，找到5个点连起来可得一直线，直线在横轴上相交，横轴上的截距= - 1/Km值，从而可算出Km值。 附注：求Km值可用1/A代替1/V ∵ 1/V = Km/Vmax﹒1/[S] + 1/ Vmax V = P/t = Au/As﹒C/t Vmax = Amax/As﹒C/t ∴ 1/Au = Km/Amax﹒1/[S] + 1/ Vmax 计算。 因此，可以用1/Au对1/[S]作图，直线在1/[S]轴上的交点也是- 1/Km，从而可算出Km值。

【数据处理】 管号 1 2 3 4 5 6 A404 1/A404 [s] 1/ [s] 以上述数据双倒数作图，求出碱性磷酸酶的Km值

【注意事项】1．加入铁氰化钾要立即摇匀。

2．本实验的要点是配制不同浓度的底物—磷酸苯二钠，因此稀释底物要准确。 3．作图时，横、纵坐标比例要合理，纵坐标轴左侧的绘图纸要留有足够的空间，使绘制的直线向下延长时能与横坐标相交，计算其Km值。

【思考题】

1．为什么酶促反应速度常以初速度表示？ 2．实验所得的各数据中，哪些易出现较大误差？ 3. 说明Km值的意义及特点